واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) یکی از پرکاربردترین و تحول‌آفرین‌ترین تکنیک‌ها در زیست‌شناسی مولکولی است که انقلابی در تشخیص، پژوهش‌های ژنتیکی و پزشکی نوین ایجاد کرده است. این روش با امکان تکثیر سریع و دقیق توالی‌های خاص DNA، ابزار قدرتمندی برای تحلیل ژن‌ها، شناسایی عوامل بیماری‌زا، بررسی جهش‌های ژنتیکی و حتی پزشکی قانونی فراهم کرده است. در این نوشتار، فرآیند PCR، مراحل اجرایی آن و کاربردهای متنوعش در علوم زیستی و پزشکی مورد بررسی قرار می‌گیرد.
تکنیک PCR یا واکنش زنجیره‌ای پلمیراز تکنیکی محبوب در زیست شناسی مولکولی است که برای تکثیر قطعات کوچک DNA یا یک ژن خاص به کار می‌رود. این روش امکان تولید تعداد زیادی نسخه از یک بخش خاص از DNA را از مقدار اولیه‌ی بسیار کمی فراهم می‌کند. واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) در سال ۱۹۸۳ توسط کری مالیس (Kary Mullis)، زیست‌شناس آمریکایی، ابداع شد. او در سال ۱۹۹۳ به دلیل این کشف تحول‌آفرین، جایزه نوبل شیمی را دریافت کرد. در دوران همه‌گیری ویروس کرونا (COVID-19)، از PCR به عنوان بخش حیاتی فرآیندهای آزمایشگاهی برای تأیید وجود ویروس در افراد مبتلا استفاده می شد.
PCR مخفف عبارت Polymerase Chain Reaction به معنای واکنش زنجیره‌ای پلیمراز است. این روش در تحقیقات پزشکی و زیست‌شناسی مولکولی برای تولید تعداد زیادی نسخه (از هزاران تا میلیون‌ها کپی) از یک بخش خاص از DNA، مانند یک ژن ویژه، به کار می‌رود.
واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) یکی از تکنیک‌های کلیدی در زیست‌شناسی مولکولی است که برای تکثیر بخش خاصی از DNA به کار می‌رود. این فرآیند با استفاده از چرخه‌های متوالی گرمایش و سرمایش انجام می‌شود و شامل سه مرحله‌ی اصلی است که در هر چرخه به‌صورت تکراری اتفاق می‌افتند. این مراحل پایه و اساس عملکرد موفق PCR را تشکیل می‌دهند.
در این مرحله، DNA دو رشته‌ای با افزایش دما از یکدیگر جدا می‌شود.
دمای واکنش کاهش می‌یابد تا پرایمرها به رشته‌های الگوی DNA متصل شوند.
با افزایش مجدد دما، آنزیم Taq پلیمراز رشته‌ی جدید DNA را سنتز می‌کند.
این سه مرحله ۲۰ تا ۴۰ بار تکرار می‌شوند و در هر چرخه، تعداد کپی‌های DNA دو برابر می‌شود. این فرآیند که چرخه‌ی حرارتی (Thermal Cycling) نام دارد، توسط دستگاهی به نام ترموسایکلر (Thermal Cycler) انجام می‌شود. بسته به سرعت دستگاه، PCR ممکن است در کمتر از یک ساعت یا طی چند ساعت تکمیل شود.
پس از اتمام PCR، از تکنیک الکتروفورز ژل برای ارزیابی میزان و اندازه‌ی قطعات DNA تولیدشده استفاده می‌شود.
• در این مرحله، مخلوط واکنش به دمای ۹۴ تا ۹۵ درجه سانتی‌گراد به مدت ۱۵ تا ۳۰ ثانیه گرم می‌شود.
• این دمای بالا باعث از بین رفتن پیوندهای هیدروژنی بین بازهای دو رشته‌ی DNA الگو شده و آن‌ها را از یکدیگر جدا می‌کند.
• در نتیجه، دو رشته‌ی مجزا از DNA تشکیل می‌شود که به‌عنوان الگو برای سنتز رشته‌های جدید DNA عمل می‌کنند.
• حفظ دمای مناسب در این مرحله برای مدت کافی ضروری است تا جدایش کامل رشته‌های DNA تضمین شود.
• در این مرحله، دمای واکنش کاهش می‌یابد تا پرایمرها از طریق پیوندهای هیدروژنی به محل مشخصی روی DNA الگوی تک‌رشته‌ای متصل شوند.
• دمای لازم برای اتصال پرایمرها بسته به ویژگی‌های آن‌ها متغیر است و معمولاً بین ۵۰ تا ۶۵ درجه سانتی‌گراد قرار دارد.
• دو رشته‌ی جداشده‌ی DNA مکمل یکدیگر بوده و در جهت‌های مخالف قرار دارند؛ به‌طوری که یک انتهای آن‌ها ۵' و انتهای دیگر ۳' است. بنابراین، برای این مرحله دو پرایمر موردنیاز است: یک پرایمر پیشرو (Forward Primer) و یک پرایمر معکوس (Reverse Primer).
• این مرحله اهمیت زیادی دارد، زیرا پرایمرها نقطه‌ی آغاز سنتز DNA را تعیین می‌کنند. آن‌ها یک ناحیه‌ی کوتاه از DNA دو رشته‌ای ایجاد کرده و به آنزیم پلیمراز اجازه می‌دهند که در مرحله‌ی بعدی (طویل‌سازی)، با استفاده از بازهای آزاد DNA، رشته‌ی مکمل جدید را بسازد.
• مرحله‌ی اتصال پرایمرها معمولاً ۱۰ تا ۳۰ ثانیه طول می‌کشد.
• در این مرحله، دمای واکنش به ۷۲ درجه سانتی‌گراد افزایش می‌یابد تا آنزیم Taq DNA پلیمراز با افزودن بازهای DNA، رشته‌ی جدیدی از DNA را سنتز کند.
• Taq DNA پلیمراز از باکتری Thermus aquaticus استخراج شده است که به اختصار "Taq" نامیده می‌شود. این باکتری به‌طور طبیعی در چشمه‌های آب گرم زندگی می‌کند و قادر است دماهای بالاتر از ۸۰ درجه سانتی‌گراد را تحمل کند، در حالی که دمای بهینه‌ی فعالیت آن ۷۲ درجه سانتی‌گراد است.
• پلیمراز استخراج‌شده از این باکتری در برابر دماهای بالا بسیار پایدار است و می‌تواند شرایط موردنیاز برای جداسازی رشته‌های DNA را در مرحله‌ی دناتوراسیون تحمل کند.
• در مقابل، پلیمراز DNA در بیشتر موجودات دیگر قادر به تحمل چنین دماهای بالایی نیست. برای مثال، پلیمراز انسانی در دمای ۳۷ درجه سانتی‌گراد (دمای طبیعی بدن) بهینه عمل می‌کند.
• در ۷۲ درجه سانتی‌گراد، آنزیم Taq پلیمراز سنتز رشته‌ی مکمل DNA را آغاز می‌کند. ابتدا به پرایمر متصل شده و سپس بازهای DNA را به‌صورت متوالی در جهت ۵ به ۳به رشته‌ی الگو اضافه می‌کند.
• این فرآیند منجر به تشکیل یک رشته‌ی جدید از DNA شده و در نهایت، یک مولکول DNA دو رشته‌ای کامل ایجاد می‌شود.
• مدت زمان این مرحله بسته به طول توالی DNA که قرار است تکثیر شود، متفاوت است. به‌طور متوسط، سنتز ۱,۰۰۰ جفت باز DNA حدود یک دقیقه طول می‌کشد.
ادامه‌ی چرخه
• فرآیند چرخه‌ی حرارتی بین ۲۰ تا ۴۰ بار تکرار می‌شود و در نتیجه، تعداد زیادی از توالی موردنظر DNA تکثیر می‌شود.
• قطعات جدید DNA که در هر چرخه سنتز می‌شوند، به‌عنوان الگوهایی برای اتصال آنزیم پلیمراز DNA عمل کرده و سنتز بیشتر DNA را آغاز می‌کنند.
• این فرآیند تکراری در مدت‌زمانی کوتاه، مقدار قابل‌توجهی از قطعه‌ی DNA هدف را تولید می‌کند.
کاربردهای PCR
PCR در زمینه‌های مختلف زیست‌شناسی و پزشکی کاربرد دارد، از جمله تحقیقات زیست‌شناسی مولکولی، تشخیص‌های پزشکی، و برخی شاخه‌های بوم‌شناسی.
گزیده خلاصه:
PCR یا واکنش زنجیره‌ای پلیمراز، یک تکنیک قدرتمند در زیست‌شناسی مولکولی و پزشکی است که برای تکثیر قطعات خاصی از DNA به کار می‌رود. این فرآیند شامل سه مرحله اصلی است: دناتوراسیون، اتصال پرایمرها و طویل‌سازی، که طی چندین چرخه حرارتی تکرار می‌شوند. PCR کاربردهای گسترده‌ای در تشخیص بیماری‌ها، تحقیقات ژنتیکی، پزشکی قانونی و بیوتکنولوژی دارد.
با ما تماس بگیرید